泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶及tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶基因研究

【摘要】泡桐丛枝病是由植原体引起的一种重要的林木病害，在中国发生和分布于北至山海关，南到长江流域的广大范围内，是国内极具代表性的植原体病害，给泡桐生产造成了严重危害，具有重要的研究价值。胸苷酸激酶催化磷酰基从ATP转移到dTMP形成dTDP，是三磷酸胸苷从头合成和补救途径的关键酶。该酶广泛存在于各种生物中，是DNA合成过程中的重要限速酶，对于生物的生存必不可缺。本文对泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶基因进行了克隆、测序、多态性分析、原核表达及纯化、体外酶活性测定、对转化大肠杆菌生长和繁殖的影响以及该基因在植原体中的表达等研究，为植原体的繁殖、致病机理研究、病害治疗的新药物设计与筛选及病害综合防治等研究奠定了基础。本研究设计引物并PCR扩增了泡桐丛枝植原体河北平山株系（PaWBPs）和江西吉安株系（PaWBJan）的tmk基因，直接和克隆测定tmk序列，利用DNAMAN、MEGA等软件进行序列多样性、序列变异、蛋白功能域、系统进化等比较分析。结果表明，从PaWBPs和PaWBJan中克隆测序的93条和41条tmk-a中，分别鉴定出52和24种不同的序列，tmk-aORF可被划分为两类，tmk-a-1为639bp，tmk-a-2为627bp，PaWBPs株系tmk-a-1与tmk-a-2序列条数的比值约为2.5，而PaWBJan株系为3.3，PaWBPs有5个相同的tmk-a-1序列与PaWBJan的一个tmk-a-1序列及枣疯植原体tmk-Y序列完全一致。因多位点突变，PaWBPs含假基因比例达48.1%，PaWBJan的为41.7%；tmk-b基因为单一序列，两株系的tmk-b核酸序列相似性为99.8%，编码蛋白仅有一个氨基酸差异。Tmk-a和tmk-b中都具有胸苷酸激酶的3个保守功能域。系统进化分析显示，泡桐丛枝植原体的两个株系的所有tmk-a序列都与枣疯植原体tmk-X和tmk-Y等聚为一个进化枝I中；而tmk-b与小麦蓝矮tmk-2等聚为另一进化枝III，基于tmk-b序列和基于16SrDNA序列构建的系统进化树一致，tmk-b有助于植原体16Sr组水平的分类，而tmk-a可用于植原体株系变异和遗传多样性分析。对从泡桐丛枝（PaWB）植原体中获得的3个预测的同源蛋白TMK-a-1、TMK-a-2及TMK-b与已报道的小麦蓝矮（WBD）、洋葱黄化（OY-W）植原体的TMK-a、TMK-b的氨基酸序列进行了比对和相似性分析，结果显示PaWBPSTMK-b与WBDTMK-2和OY-WTMK-b之间的相似性分别为95.65%和99.03%；PaWBPSTMK-a-1与PaWBPSTMK-a-2的相似性为90.57%，且二者与WBDTMK-1和OY-WTMK-a之间的相似性为87.32%-94.26%；而PaWBPS、WBD、OY-W三种植原体的TMK-a与TMK-b之间的相似性仅为22.22%-25.95%。构建了PaWBPSTMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2的pET28a原核表达载体，对PaWBPSTMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2三种蛋白分别进行了原核表达，经Ni-NTA柱纯化后进行了酶催化活性测定，结果表明，PaWBPSTMK-b具有较高的胸苷酸激酶活性，为85.960.74U·mg-1，而PaWBPSTMK-a-1和TMK-a-2几乎没有胸苷酸激酶活性。通过生长曲线的测定，研究了在BL21（DE3）大肠杆菌细胞中表达的PaWBTMK-a-1、TMK-a-2和TMK-b蛋白对细菌生长和繁殖的影响，结果表明，PaWBTMK-a-1、TMK-a-2和TMK-b对对数生长后期大肠杆菌的繁殖都有显著的促进作用，PaWBTMK-b对大肠杆菌繁殖的促进作用最明显，PaWBTMK-a-1和TMK-a-2次之，并且PaWBTMK-a-1和TMK-a-2对细胞繁殖的促进作用的强弱无明显差异。该研究结果也表明，体外测定无胸苷酸激酶活性的PaWBTMK-a-1和TMK-a-2可能在植原体细胞内以不同于TMK-b的方式发挥着重要功能。本研究制备了PaWBtmk-a-1、tmk-b及16SrDNA（对照）基因DNA探针，用泡桐丛枝植原体RNA在42℃和68℃杂交条件下进行的Northernblot结果显示，泡桐丛枝植原体中含有大量表达的16SrRNA；但16SrDNA探针也能从健康泡桐总RNA中检测到杂交信号；然而用PaWBtmk-a-1、tmk-b探针并未检测到PaWBtmk-a-1和tmk-b基因mRNA的杂交信号，这可能是由于tmk-a-1和tmk-b基因表达的mRNA的量很低或该基因存在尚不清楚的特殊时空表达特性导致的。另外，通过对PaWB16SrDNA与拟南芥、烟草、毛果杨等植物叶绿体16SrDNA及线粒体rRNA序列比对分析后发现，PaWB16SrDNA与这些物种的叶绿体16SrDNA序列相似性值均在70%以上，据此推测，用PaWB16SrDNA探针从健康泡桐总RNA中检测到的杂交信号很可能源于和PaWB16SrDNA高度同源的泡桐叶绿体16SrDNA或线粒体rRNA。用纯化的原核表达蛋白免疫德国大白兔，分别制备了PaWBTMK-a-1和TMK-b的多克隆抗体。对泡桐丛枝植原体蛋白进行的Westernblot、FITC免疫荧光显微镜及免疫电镜结果表明，表现典型丛枝症状的泡桐组培苗体内仅检测到PaWBTMK-a-1和TMK-b蛋白微弱的表达。然而，利用PaWBTMK-a-1和TMK-b抗体从健康泡桐总蛋白中也检测到了和PaWBTMK蛋白大小相似的Westernblot印迹条带，用FITC免疫荧光显微镜在健康泡桐茎部皮层细胞也观测到该蛋白特异荧光。通过对PaWBTMK-a-1、PaWBTMK-b、AtTMPK全长及来源于转录组测序的泡桐TMK蛋白的部分氨基酸序列进行的比对和抗原决定簇序列分析发现，以上4种蛋白为同源蛋白，并且它们的多个抗原决定簇序列之间有高度的相似性，据此可推测，这些高度相似的抗原决定簇可能是健康泡桐总蛋白中出现交叉血清学反应的原因。利用PaWBTMK-a-1和TMK-b抗体进行的免疫电镜表明，泡桐细胞核和叶绿体上有大量的免疫胶体金颗粒，这也从亚细胞水平揭示了健康泡桐在Westernblot印迹时出现条带的原因和蛋白可能的存在部位。本研究结果也为植原体与寄主植物可能存在的内共生学说提供了有力的实验证据。tRNA-IPT基因编码的蛋白tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶（EC2.5.1.8）,能催化二甲烯二磷酸（DMAPP）的异戊烯基转移到前体tRNA分子反密码子附近的腺嘌呤残基上。tRNA的这种修饰能够影响蛋白质翻译的保真度及效率；这种被修饰的tRNA降解产生异戊烯基腺嘌呤，可能具有细胞分裂素活性。通过测定转化有PaWBtRNA-ipt基因的大肠杆菌生长曲线，研究了PaWBtRNA-IPT蛋白对细胞生长和繁殖的影响，结果表明，PaWBtRNA-IPT对大肠杆菌的生长和繁殖具有显著的促进作用。比较转化有tRNA-IPT和tRNA-IPT（基因内部发生了碱基突变导致tRNA-IPT蛋白的编码提前终止）的大肠杆菌生长曲线后发现，在0.25至1.0mMIPTG诱导时，转化tRNA-IPT和pET28a空载体大肠杆菌的繁殖都受到IPTG的明显抑制，而转化有tRNA-IPT的大肠杆菌的繁殖几乎未受抑制。该结果表明PaWBtRNA-IPT突变体能够克服IPTG对大肠杆菌生长的抑制作用。为了进一步研究该基因的功能，本研究成功构建了PaWBtRNA-ipt基因的植物表达载体Cam35S-GFPtRNA-IPT。用花粉管介导法进行拟南芥转化试验，对收获种子进行转化效果测定，但结果未检测到外源基因的整合。
【作者】宋传生；
【导师】田国忠；
【作者基本信息】中国林业科学研究院，森林保护学，2014，博士
【关键词】泡桐丛枝病；植原体；胸苷酸激酶；tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶；原核表达；抗体制备；生长曲线；酶活性；基因表达；

【参考文献】
[1]魏建琳.数据库技术的发展及互操作的实现[J].西安文理学院学报(自然科学版),2005,03:80-84.
[2]杨松青.北京市第三产业发展问题研究[J].北京市经济管理干部学院学报,2014,03:14-19+30.
[3]陈杰.五年制高职财经类专业数学教学现状及其对策研究[D].苏州大学,教育（专业学位）,2012,硕士.
[4]周家继.多雷达航迹融合算法应用与研究[D].云南大学,软件工程,2012,硕士.
[5]李祖平,陈文强,王世锋.上虞:多层次协同创新驱动转型升级[J].今日科技,2014,12:15-20.
[6]赫亮.基于Hi3515的数据参数及视频图像监控系统[D].广东工业大学,控制工程,2013,硕士.
[7]李茹.氧化镁粉体的制备与改性及其绝缘性能[D].内蒙古工业大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[8]黄波.基于BizTalk的信息整合平台[D].武汉理工大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[9]陈汉棚.新疆维吾尔族建筑文化对现代餐饮空间设计的影响[D].北方工业大学,设计艺术学,2013,硕士.
[10]杨玉娇.染料敏化太阳能电池光阳极纳米片与纳米球的研发与制备[D].青海大学,材料学,2014,硕士.
[11]何小丽.基于锰氧化物的直接甲醇燃料电池阳极催化剂研究[D].湖南大学,2014.
[12]曹蓟光,王申康.基于数据仓库的综合知识发现系统的研究与应用[J].计算机应用研究,2001,03:68-70+86.
[13]宋影.酸铝胁迫下西南林区三种土著外生菌根真菌活化利用无机磷源的研究[D].西南大学,森林培育,2014,硕士.
[14]曾祥如.电子商务对我国现行税法的冲击及对策[D].内蒙古大学,法律,2014,硕士.
[15]芦伟,贾玉萍,林菁菁,陈莲莲,郭丽伟,陈小龙.SiC(000-1)面上外延石墨烯的特征[A].中国物理学会X-射线衍射专业委员会、中国晶体学会粉末衍射专业委员会、国家自然科学基金委员会工程与材料科学部、北京市硅酸盐学会、中国科学院物理研究所、InternationalCentreforDiffractionData,USA.第十一届全国X射线衍射学术大会暨国际衍射数据中心（ICDD）研讨会论文摘要集[C].中国物理学会X-射线衍射专业委员会、中国晶体学会粉末衍射专业委员会、国家自然科学基金委员会工程与材料科学部、北京市硅酸盐学会、中国科学院物理研究所、InternationalCentreforDiffractionData,USA:,2012:1.
[16]范玉雪.国产长篇动画的民族性问题研究[D].信阳师范学院,文艺学,2014,硕士.
[17]徐建涛.复杂条件下管幕—冻结地层预处理技术研究[D].北京交通大学,2014.
[18]陈飞翼.老挝琅勃拉邦省城市污水排放管理对策研究[D].广西民族大学,行政管理,2013,硕士.
[19]梁美红.哥本哈根进程中英国职业教育改革研究[D].湖南师范大学,比较教育学,2014,硕士.
[20]丁文超.不同气体压力的自发瑞利布里渊散射频谱特性的研究[D].南昌航空大学,光学工程（专业学位）,2013,硕士.
[21]张桐.微生活对大学生的影响[J].艺术科技,2013,11:450+454.
[22]田辽,张克平,覃征.贝叶斯构造网络算法在电信CRM中的应用[J].现代电子技术,2005,10:52-54+57.
[23]刘华钧.法官身份保障制度研究[D].浙江工商大学,诉讼法学,2013,硕士.
[24]谢莉.论民事起诉审查[D].内蒙古大学,法律,2014,硕士.
[25]刘宝泉.智能充电器设计与实现[D].西北工业大学,信号与信息处理,2004,硕士.
[26]史入宇.地下水严格管理示范性建设技术研究[D].中国地质大学（北京）,地下水科学与工程,2013,硕士.
[27]赵刚,王斌,于海琴,王盈盈,孙慧德.不同C/N对一体化MBR中微生物产物的影响[J].水处理技术,2014,05:92-94+98.
[28]杨金凤.内部控制质量对会计信息透明度的影响研究[D].东北财经大学,会计学,2012,硕士.
[29]蓝翁驰.微量元素营养平衡糖尿病饮食疗法研究[D].中央民族大学,生态学,2004,硕士.
[30]张驰.基于HOOPS/ACIS的船体分段坐标测量前处理系统[D].大连理工大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[31]赵雅恒.社会工作介入丧偶老人生活适应问题研究[D].南京农业大学,社会工作,2013,硕士.
[32]王勇.甲状腺乳头状癌中TGF-β1、CD31表达及临床意义[D].承德医学院,肿瘤学,2011,硕士.
[33]张磊.Ⅲ-Ⅴ族（GaN）和Ⅱ-Ⅵ族（ZnTe）半导体材料的制备及光学特性研究[D].山东大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[34]王浩.基于面向对象的高分辨率遥感影像车辆提取方法研究[D].北京交通大学,摄影测量与遥感,2013,硕士.
[35]贾阳.基于视频的大空间建筑火灾探测方法研究[D].西安建筑科技大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[36]穆正洋.改性聚乳酸及其发泡材料的制备与性能研究[D].江苏科技大学,材料学,2013,硕士.
[37]牛晓莉.对外汉字教材中笔画内容的设计及其教学研究[D].安徽大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[38]平义.中国合同能源管理项目融资模式研究[D].西安建筑科技大学,工程经济与管理,2013,硕士.
[39]王颖云.血清水通道蛋白4抗体在视神经炎疾病中的分布及相关因素分析[D].中国人民解放军医学院,眼科学,2013,硕士.
[40]姚敏,沈斌,易文晟.基于知识生命期的数据挖掘方法研究[J].系统工程理论与实践,2004,02:74-78.
[41]张明.图像处理和数值分析在加热炉钢坯中的应用[D].安徽大学,光学,2014,硕士.
[42]郭梅.大尺寸复合材料注塑件模流分析及工艺参数优化[D].浙江工业大学,2012.
[43]刘晓俊.鄂尔多斯农村商业银行品牌建设研究[D].内蒙古大学,工商管理,2012,硕士.
[44]杨玉峰.铁炭微电解组合工艺预处理高浓度难降解有机废水的研究[D].浙江工业大学,2009.
[45]蒋一鸣,林起浪,杨友结,郑瑞刚.氰酸酯树脂/氧化石墨烯纳米复合材料的制备及表征[J].高分子材料科学与工程,2012,03:134-136.
[46]王建丽.初中生英语学习自我评价的作用研究[D].扬州大学,学科教学,2012,硕士.
[47]沈佳英.肺癌Ⅰ号方对小鼠Lewis肺癌端粒酶活性与Survivin表达影响的实验研究[D].云南中医学院,中西医结合基础,2012,硕士.
[48]刘旋.风电机组塔架有限元分析与结构参数多目标优化[D].湖南科技大学,机械工程,2013,硕士.
[49]唐屹.基于agent的入侵检测系统研究[J].广州大学学报(自然科学版),2002,05:29-33.
[50]汤尧.胆总管切开取石术中应用鼻胆管代替T管引流-Meta分析[D].苏州大学,临床医学（专业学位）,2014,硕士.